| 【关键词】 B淋巴细胞亚群； 肝炎，乙型，慢性； 肝炎病毒，乙型；流式细胞术 Changes of peripheral blood B lymphocyte subsets in chronic hepatitis B patients and chronic asymptomatic HBV carriers QIN Hao-ge, YAN Ying-chun, WU Xiao-feng, LIU Pei. 【Key words】 B-lymphocyte subsets; Chronic hepatitis B; Hepatitis B virus; Flow cytometry 【First author抯 address】 Department of Infectious Diseases, Second Affiliated Hospital, China Medical University , Shenyang 110004, China Corresponding author: LIU Pei, Email: syliupei2003@yahoo.com.cn 细胞免疫反应对乙型肝炎病毒（HBV）的清除作用已得到充分的研究和重视，宿主对HBV的免疫应答，需要Ｔ、B细胞间的密切合作，而B细胞在宿主抗HBV免疫应答中的作用研究较少。为探讨体液免疫在慢性HBV感染者中的变化，我们检测了慢性无症状乙型肝炎病毒携带者（AsC）、慢性乙型肝炎（CHB）患者和正常对照者外周血中CD5+B细胞（CD5+CD19+）、传统B细胞（CD5-CD19+）、全B细胞（CD19+）和全T细胞（CD5+）百分率。 一、资料与方法 1．病例资料：沈阳市传染病院2003年10月-2004年4月住院患者，其中AsC 组12例，男9例，女3例，年龄13～47岁，中位数31.7岁；CHB 组21例，男14例，女7例，年龄11～56岁，中位数32.8岁。病例均符合2000年修订的病毒性肝炎临床诊断标准[1]，AsC限定为乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）持续存在6个月以上，无肝病相关症状和体征，血清氨基转移酶正常，HBV DNA阳性的HBV感染者。排除甲、丙、丁、戊及其他肝炎病毒重叠感染，排除脂肪肝和自身免疫性肝病，近6个月未接受糖皮质激素、白细胞介素2、胸腺肽及干扰素治疗。正常健康对照组10名，男6名，女4名，年龄26～52岁，中位数33.8岁。 2．主要试剂和仪器：异硫氰酸荧光素（FITC）/藻红蛋白（PE）标记的配对小鼠抗人单克隆抗体（FITC-CD5/PE-CD19、FITC-IgG1/PE-IgG1）、氯化铵裂解液和FACSort流式细胞仪均购自美国BD公司。 3．检测方法：采集清晨空腹静脉血2ml，乙二胺四乙酸三钾（EDTA-K3）抗凝，3h内进行细胞表型分析。采用间接免疫荧光标记法，两管抗凝外周血各100 μl，分别加入FITC-CD5/PE-CD19和FITC-IgG1/PE-IgG1荧光抗体（空白对照）20μl摇匀，避光，4℃放置30min；加1%氯化铵裂解液2ml，避光，室温放置10min以上。待红细胞完全溶解后，1500r/min离心5min，弃去上清液。磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2次，洗去游离抗体后加入0.9ml PBS，上流式细胞仪。用流式细胞仪和CELL QUEST软件进行荧光参数获取和分析，获取样本中1×104个细胞中淋巴细胞的相应标记表达率。 4．统计学分析：数据以x-±s表示，采用统计软件SPSS 11.5进行方差齐性检验后进行t检验。 二、结果 CHB组的CD19+和CD5+CD19+细胞百分率高于正常对照组，差异有统计学意义（t＝3.53，t＝3.08，P值均<0.01），而CD5+和CD5-CD19+细胞的百分率在两组间差异无统计学意义（P>0.05）。AsC组与正常对照组比较，CD5+CD19+、CD5-CD19+、CD19+和CD5+细胞的百分率差异均无统计学意义（P>0.05）。CHB组与AsC组比较，CD19+和CD5+CD19+细胞的百分率，CHB组高于AsC组，差异有统计学意义（t＝4.51、3.20，P值均<0.01）；而CD5+和CD5-CD19+细胞的百分率在两组间差异无统计学意义（P>0.05），见表1和图1～3。 三、讨论 活化的B细胞是一类抗原提呈细胞，能产生大量参与免疫调节、炎症反应及造血过程的细胞因子。依照CD5的表达与否可把B细胞分成CD5+CD19+和CD5-CD19+细胞。CD5+CD19+细胞又称B-1细胞，是在胎儿期即已表达CD5的B细胞，它是一组独立的B细胞亚群，其功能为：（1）通过产生抗细菌抗体抗微生物感染；（2）通过产生多反应性自身抗体清除变性的自身抗原；（3）通过产生致病性自身抗体诱导自身免疫病[2]。CD5-CD19+细胞也叫B-2细胞，是出生后不再表达CD5的B细胞，也就是通常所指的B细胞。CD5-CD19+细胞是参与特异性体液免疫应答的B细胞，其三个主要功能是：产生抗体、提呈抗原和分泌细胞因子参与免疫调节。抗体以三种主要方式参与免疫反应：中和作用、调理作用和补体参与调理作用。 CD19分子分布于除浆细胞外的B细胞谱系发育各个阶段，是B细胞的重要标记。陈胜等[3]用CD20细胞代表总B细胞数，但CD20在B细胞激活后逐渐消失，而CD19不消失[4]。 乙型肝炎是一种免疫相关性疾病，机体感染HBV后并不直接对肝细胞造成损伤，而是通过诱发机体的免疫应答间接损伤肝细胞[5, 6]。B淋巴细胞亚群是否参与了CHB的发病，以及其与慢性HBV感染状态的关系值得探讨。实验结果表明，正常人外周血中CD5+CD19+细胞约占2.2%，与文献[7]报道基本相符。CHB患者外周血CD5+CD19+细胞百分率明显高于正常对照组和AsC组。AsC组与正常对照组外周血CD5+CD19+细胞百分率差异不明显，说明了CHB患者体内有较多的CD5+CD19+细胞活化，可能CD5+CD19+细胞与CHB的发病有关。CD5-CD19+细胞未见增加，其百分率在CHB、AsC和对照组组间差异无统计学意义，也就不能中和抗原，这是否是HBV持续感染的原因之一有待进一步研究证实。 参考文献 1Chinese Society of Infectious Diseases and Parasitology and Chinese Society of Hepatology of Chinese Medical Association. The progamme of prevention and cure for viral hepatitis. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2000, 8: 324-329. 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会．病毒性肝炎防治方案.中华 肝脏病杂志,2000,8:324-329． 2Chen WF, ed. Medical immunology. 3rd. Beijing: People抯 Medical Publishing House, 2004. 112-114. 陈慰峰,主编.医学免疫学.第3版.北京:人民卫生出版社,2004.112-114． 3Chen S, Xiao JS. Changes of peripheral blood lymphocyte subsets and their immulogical value in hepatitis. Guangdong Yixue, 2001, 22: 1127-1128. 陈胜，肖杰生．病毒性肝炎患者外周血淋巴细胞亚群的变化及其免疫学意义.广东医学,2001,22:1127-1128． 4Luo KX, ed. Hepatis B, basic biology and clinical science. 2nd. Beijing: People抯 Medical Publishing House, 2001. 133. 骆抗先,主编.乙型肝炎基础和临床.第2版.北京:人民卫生出版社,2001.133． 5Maini MK, Boni C, Lee CK, et al. The role of virus-specific CD8(+) cells in liver damage and viral control during persistent hepatitis B virus infection. J Exp Med, 2000, 191: 1269-1280. 6Maini MK, Boni C, Ogg GS, et al. Direct ex vivo analysis of hepatitis B virus-specific CD8(+) T cells associated with the control of infection. Gastroenterology, 1999, 117: 1386-1396. 7Han Z, Xu WZ, Liu M, et al. Change of CD5+B cell in patients with myasthenia gravis. Zhongguo Mianyixue Zazhi, 2000, 16: 160-162. 韩钊,徐文桢,刘鸣,等.重症肌无力患者CD5+B细胞的变化．中国免疫学杂志,2000,16:160-162． |
